以CRISPR輔助的RNA結合蛋白細胞活檢新方法

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儘管科學家仍未完全掌握RNA(核糖核酸)分子複雜多樣的性質,但普遍認為與它們結合的蛋白質、即RNA結合蛋白,與許多疾病的形成有關。由香港城市大學(香港城大)生物醫學家領導的一項研究,開發了一種名為CARPID的新型檢測方法,能夠檢測活細胞內與RNA結合的蛋白質。這項新技術有望應用於各種的生物醫學研究,包括找出能夠幫助診斷癌症的生物標誌物,以及找出治療病毒疾病的潛在藥物靶點。

聯合研究團隊主要由香港城大和位於西安的西北大學的科學家組成,並由香港城大生物醫學系的嚴健博士張亮博士陳居明博士共同領導。研究結果早前在科學期刊《自然方法》(Nature Methods)上發表,題為〈CRISPR-assisted detection of RNA–protein interactions in living cells〉

結合蛋白決定RNA的功能

根據分子生物學的中心法則(central dogma),DNA經由轉錄作用生成RNA,再經轉譯作用製造蛋白質。然而,實際上只有大約2%的RNA能製造蛋白質;其餘98%稱為非編碼RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)的,則因功能未明而被視為細胞中的「暗物質」。

近年科學家嘗試努力破解非編碼RNA到底有何實際功能,尤其是長度超過200個核苷酸(nucleotides)的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNA)。lncRNA被普遍認為是參與基因表達調控的重要成分。嚴博士形容lncRNA為「最有趣的一類RNA」,研究團隊亦因此作深入研究。

雖然lncRNA不會製造蛋白質,但會與蛋白質結合,而它們與蛋白質之間的相互作用就決定其功能。所以要了解lncRNA的實際功能,找出與之結合的蛋白質是重要的一步。不過,當前找出結合蛋白的方法有不少局限,例如會產生假陽性的信號,並且不能在活細胞中進行。

CARPID的兩個步驟:導航定位及生物素標記

為克服這些局限,研究團隊開創出一種新穎的方法,借助現時最先進的基因編輯技術CRISPR/dCasRx系統(無RNA酶切活性的CRISPR/CasRx)作為導航、找出目標RNA的工具,再運用鄰近生物素標記技術,找出活細胞中RNA與蛋白質的相互作用。

研究團隊將新技術取名為CRISPR-Assisted RNA-Protein Interaction Detection Method, 簡稱CARPID。嚴博士介紹說:「大部分現有方法只能應用於較長的非編碼RNA,但CARPID可以靈敏地檢測出任何長度的RNA結合蛋白。」

CARPID有兩個步驟:分別是導航定位及生物素標記。首先,研究團隊利用CRISPR/dCasRx系統為導航工具,將CARPID的「標記工具」BASU牽引至目標RNA附近。BASU是一種生物工程改造的生物素連接酶,可以將生物素(一種結合力強的維他命)加到與目標RNA鄰近的蛋白質上,成為標記。

由於這些蛋白質都帶有BASU的生物素「記號」,研究人員之後只需要運用鏈霉親和素(streptavidin,一種會與生物素結合的蛋白質),便能輕易找出被BASU標記過的蛋白質。

Scheme of CARPID
黃色的部分顯示透過CRISPR的導航定位,CARPID的「標記工具」(BASU)會被牽引至目標RNA附近。BASU將生物素(B)標記於與目標RNA結合的蛋白質(RBP)上。之後研究人員用鏈霉親和素(MyOne T1)就可以找出被標記的蛋白質。(圖片來源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

具高度特異性並適用於不同長度的lncRNA

為了測試CARPID的特異性,研究團隊將它應用於DANCR、XIST和MALAT1這三種lncRNA上。實驗結果顯示,沒有檢測出太多重疊的結合蛋白,證明了CARPID適用於不同長度以及表達水平的lncRNA,並且具有高度的特異性。

Specificity
研究團隊將CARPID應用在三種lncRNA上。實驗結果沒有檢測出太多重疊的結合蛋白質,證明了CARPID具有高度的特異性。(圖片來源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

嚴博士解釋說:「CARPID能夠達致高特異性,可歸功於CRISPR的精確導航,技術甚至精確得讓我們可以知道蛋白質在整條RNA的哪一小段結合。」

此外,CARPID不會影響目標細胞的生理狀況,也不會殺死細胞,完成整個檢測過程後,該細胞仍然具有正常的基因表達譜系。張博士補充說:「使用這種新方法,在不同時間檢測相同的目標RNA,就可以得出動態的檢測結果。」

在CARPID的基礎上,研究團隊運用張博士開發的蛋白質分析技術,更加發現和驗證了哺乳動物細胞中,其中一組lncRNA的兩種未曾被報道過的結合蛋白。

cellular localization
研究團隊將CARPID應用在同一組lncRNA(XIST)的不同位置(L1, L2, L3)上,以找出結合蛋白。早前已被發現的結合蛋白以橙色字體標示,而這次研究新找到的兩種結合蛋白TAF15和SNF2L則以藍色字體標示。(圖片來源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

Protein signal
圖中的紅色信號代表XIST lncRNA,而綠色信號代表一種通過CARPID新發現、未曾報道過的XIST結合蛋白TAF15。黃色信號則代表XIST與TAF15有重疊,即兩者結合了。(圖片來源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

能檢測與病毒RNA結合的蛋白質

研究團隊認為CARPID能被廣泛應用,包括檢測病毒RNA的結合蛋白。 「舉個例子,SARS-CoV-2就是一種引起COVID-19的RNA病毒。一旦細胞受病毒感染,我們就可以用CARPID來檢測該RNA病毒在病毒生命週期中與哪些細胞蛋白結合。如果我們能夠減少這些結合蛋白的數量,或者可以抑制病毒的複製。這些信息可能有助我們找到潛在的抗病毒藥物靶點。」嚴博士進一步解釋。

此外,許多lncRNA在癌細胞中的數量會比於正常細胞內更多,所以被視為診斷癌症的生物標誌物。 CARPID可用於檢測癌細胞中這些lncRNA的結合蛋白,或有助於找出致癌機制以及用於癌症診斷或治療的潛在藥物靶點。

團隊花上大約一年時間研發CARPID,當中大部分實驗都在香港城大進行。他們下一步會嘗試將其應用於幹細胞和DANCR(促進腫瘤生長的lncRNA)的研究。

嚴博士、張博士和負責驗證CARPID的陳博士都是論文的共同通訊作者。論文的共同第一作者包括同樣來自生物醫學系的李靖宇朱孝軒,以及來自西北大學的易文凱王曦博士

CityU research team
香港城大研究團隊成員:(前排左起)張亮博士、嚴健博士和陳居明博士;(後排左起)樊立剛、易文凱、朱孝軒和李靖宇。

 

這項研究獲得香港城大、國家自然科學基金委員會、深圳市科技創新委員會、香港研究資助局、西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室開放基金等的資助進行。

DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0

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