以CRISPR辅助的RNA结合蛋白细胞活检新方法

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尽管科学家仍未完全掌握RNA(核糖核酸)分子复杂多样的性质,但普遍认为与它们结合的蛋白质、即RNA结合蛋白,与许多疾病的形成有关。由香港城市大学(香港城大)生物医学系学者领导的一项研究,开发了一种名为CARPID的新型检测方法,能够检测活细胞内与RNA结合的蛋白质。这项新技术有望应用于各种的生物医学研究,包括找出能够帮助诊断癌症的生物标志物,以及找出治疗病毒疾病的潜在药物靶点。

联合研究团队主要由香港城大和位于西安的西北大学的科学家组成,并由香港城大生物医学系的严健博士张亮博士陈居明博士共同领导。研究结果早前在科学期刊《自然方法》(Nature Methods)上发表,题为〈CRISPR-assisted detection of RNA–protein interactions in living cells〉

结合蛋白决定RNA的功能

根据分子生物学的中心法则(central dogma),DNA经由转录生成RNA,再经翻译作用生成蛋白质。然而,实际上只有大约2%的RNA能编码蛋白质;其余98%称为非编码RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)的,则因功能未明而被视为细胞中的 “暗物质”。

近年科学家尝试努力破解非编码RNA到底有何实际功能,尤其是长度超过200个核苷酸(nucleotides)的长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNA)。lncRNA被普遍认为是参与基因表达调控的重要细胞成分。严博士形容lncRNA为 “最有趣的一类RNA”,研究团队亦因此作深入研究。

虽然lncRNA不会产生蛋白质,但会与蛋白质结合,而它们与蛋白质之间的相互作用就决定其功能。所以要了解lncRNA的实际功能,找出与之结合的蛋白质是重要的一步。不过,当前找出结合蛋白的方法有不少局限,例如会产生假阳性的信号,并且不能在活细胞中进行。

CARPID的两个步骤:导航定位及生物素标记

为克服这些局限,研究团队开创出一种新颖的方法,借助现时最先进的基因编辑技术CRISPR/dCasRx系统(无RNA酶切活性的CRISPR/CasRx)作为导航、找出目标RNA的工具,再运用邻近生物素标记技术,找出活细胞中RNA与蛋白质的相互作用。

研究团队将新技术取名为CRISPR-Assisted RNA-Protein Interaction Detection Method, 简称CARPID。严博士介绍说: “大部分现有方法只能应用于较长的非编码RNA,但CARPID可以灵敏地检测出任何长度的RNA结合蛋白。”

CARPID有两个步骤:分别是导航定位及生物素标记。首先,研究团队利用CRISPR/dCasRx系统为导航工具,将CARPID的 “标记工具”BASU牵引至目标RNA附近。BASU是一种生物工程改造的生物素连接酶,可以将生物素(一种结合力强的维生素)加到与目标RNA邻近的蛋白质上,成为标记。

由于这些蛋白质都带有BASU的生物素 “记号”,研究人员之后只需要运用链霉亲和素(streptavidin,一种会与生物素结合的蛋白质),便能轻易找出被BASU标记过的蛋白质。

Scheme of CARPID
黄色的部分显示透过CRISPR的导航定位,CARPID的 “标记工具”(BASU)会被牵引至目标RNA附近。BASU将生物素(B)标记于与目标RNA结合的蛋白质(RBP)上。之后研究人员用链霉亲和素(MyOne T1)就可以找出被标记的蛋白质。(图片来源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

具高度特异性并适用于不同长度的lncRNA

为了测试CARPID的特异性,研究团队将它应用于DANCR、XIST和MALAT1这三种lncRNA上。实验结果显示,没有检测出太多重叠的结合蛋白,证明了CARPID适用于不同长度以及表达水平的lncRNA,并且具有高度的特异性。

Specificity
研究团队将CARPID应用在三种lncRNA上。实验结果没有检测出太多重叠的结合蛋白质,证明了CARPID具有高度的特异性。(图片来源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

严博士解释说: “CARPID能够达致高特异性,可归功于CRISPR的精确导航,技术甚至精确到让我们可以知道蛋白质在整条RNA的哪一小段结合。”

此外,CARPID不会影响目标细胞的生理状况,也不会杀死细胞,完成整个检测过程后,该细胞仍然具有正常的基因表达谱系。张博士补充说: “使用这种新方法,在不同时间检测相同的目标RNA,就可以得出动态的检测结果。”

在CARPID的基础上,研究团队运用张博士开发的蛋白质分析技术,更加发现和验证了哺乳动物细胞中,其中一组lncRNA的两种未曾报道过的结合蛋白。

cellular localization
研究团队将CARPID应用在同一组lncRNA(XIST)的不同位置(L1, L2, L3)上,以找出结合蛋白。早前已被发现的结合蛋白以橙色字体标示,而未曾报道过的两种结合蛋白TAF15和SNF2L则以蓝色字体标示。(图片来源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

Protein signal
图中的红色信号代表XIST lncRNA,而绿色信号代表一种通过CARPID新发现、未曾报道过的XIST结合蛋白TAF15。黄色信号则代表XIST与TAF15有重叠,即两者结合了。(图片来源: DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0)

 

能检测与病毒RNA结合的蛋白质

研究团队认为CARPID能被广泛应用,包括检测病毒RNA的结合蛋白。  “举个例子,SARS-CoV-2就是一种引起COVID-19的RNA病毒。一旦细胞受病毒感染,我们就可以用CARPID来检测该RNA病毒在病毒生命周期中,与哪些细胞蛋白结合。如果我们能够减少这些结合蛋白的数量,或许可以抑制病毒的复制。这些信息可能有助于我们找到潜在的抗病毒药物靶点。”严博士进一步解释。

此外,许多lncRNA在癌细胞中的数量会比于正常细胞内更多,所以被视为诊断癌症的生物标志物。 CARPID可用于检测癌细胞中这些lncRNA的结合蛋白,或有助于找出致癌机制以及用于癌症诊断或治疗的潜在药物靶点。

团队花上大约一年时间研发CARPID,当中大部分实验都在香港城大进行。他们下一步会尝试将其应用于干细胞和DANCR(促进肿瘤生长的lncRNA)的研究。

严博士、张博士和负责验证CARPID的陈博士都是论文的共同通讯作者。论文的共同第一作者包括同样来自生物医学系的李靖宇朱孝轩,以及来自西北大学的易文凯王曦博士

CityU research team
香港城大研究团队成员:(前排左起)张亮博士、严健博士和陈居明博士;(后排左起)樊立刚、易文凯、朱孝轩和李靖宇。

 

这项研究获得香港城大、国家自然科学基金委员会、深圳市科技创新委员会、香港研究资助局、西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室开放基金等的资助进行。

DOI number: 10.1038/s41592-020-0866-0

本文已于 “香港城大研创” 微信公众号发布。
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