快速檢測小分子核糖核酸(microRNAs)的細胞內活檢技術

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小分子核糖核酸(下簡稱miRNA)近年在關於癌症或其他人類疾病的研究中越來越受關注,其表達的變化與異常的細胞功能有著密切的關係。香港城市大學(香港城大)一支研究團隊最近開發了一種運用金剛石*納米針的新型細胞內活檢技術,能夠對miRNA進行快速和靈敏度高的高通量檢測。該技術只需要約10分鐘,就可以從活細胞中分離出目標miRNA,操作簡單兼可應用於其他方面,包括用在COVID-19等病毒的核酸檢測,以及早期癌症篩查。

*金剛石是打磨成鑽石之前的原石,有天然金剛石和人造金剛石兩種;人造金剛石通常作工業或其他科技應用。

有關研究由香港城大生物醫學工程學系副教授史鵬博士領導。研究結果剛在科學期刊《科學進展》(Science Advances)上發表,題為〈High-throughput intracellular biopsy of microRNAs for dissecting the temporal dynamics of cellular heterogeneity〉。

近乎單細胞的miRNA分析


miRNA是短鏈非編碼RNA的片段,負責基因表達的轉錄後調控,精密地調控細胞分化、增殖和存活等不同的生物過程。

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)是目前最普遍的miRNA分析方法,但是成本高且過程複雜,牽涉從細胞裂解物中分離、純化和擴增RNA等過程,因此處理費時費力。此外,單細胞個體之間存在一定的差異,但傳統的PCR方法只能對數以萬計細胞的miRNA平均水準進行測量。而區別細胞個體的差異對於識別和檢測稀有細胞,例如癌症幹細胞(引致癌症復發和轉移的主要因素之一),尤其重要。

針對這些不足之處,香港城大研究團隊成功開發了一種命名為 「inCell-Biopsy」的高通量細胞內活檢技術,作為miRNA檢測的替代方法。該技術無需進行分離、純化和擴增RNA的過程,實驗操作大為簡化。因此,所需的處理時間從數小時大幅縮減至只需要約10分鐘。

該技術以團隊早前開發的「分子垂釣」(“molecular fishing”)系統為基礎,將金剛石納米針用作「魚竿」,並加上會與RNA結合的蛋白質P19,用作「魚鈎」。 P19可以與所有長度為19至24個核苷酸的雙鏈RNA結合。操作的時候「魚竿」會刺穿細胞膜,然後直接拉出由「魚鈎」捕獲(即與P19結合了)的多個目標miRNA,而被刺穿的細胞仍然存活。隨後研究人員會分析數以萬計的金剛石納米針上的「漁穫」,從而對數千被同時活檢的細胞實現近乎是單細胞的miRNA分析。

inCell-Biopsy技術以金剛石納米針為「魚竿」,並加上會與RNA結合的蛋白質P19為「魚鈎」。 納米針會刺穿細胞膜,然後直接拉出由「魚鈎」捕獲的多個目標miRNA,而被刺穿的細胞仍然存活。(視頻來源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971) 

史博士解釋說:「目前每次納米針的穿刺我們可以同時檢測9個目標miRNA,這個數量可以通過改良以進一步提高。而且,每一片包含金剛石納米針的生物晶片都可以清洗,並重複使用至少50次以上。」金剛石納米針由材料科學講座教授張文軍教授研製,並已由香港城大取得專利。

Fishing miRNAs from individual living cells
圖解細胞內miRNA活檢技術。金剛石納米針被用作「魚竿」,而會與RNA結合的蛋白質P19則被用作「魚鈎」,由活細胞中拉出多個目標miRNA。(圖片來源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971)

 

捕捉同一細胞群在不同時間miRNA表達的變化

有別於以PCR為基礎的檢測方法需要裂解細胞樣本(即細胞已經死亡)來獲取RNA,採用團隊開發的細胞內活檢技術,細胞被納米針刺穿後仍然健康。因此,研究人員可以多次分析同一細胞群,以監測與細胞功能相關的miRNA變化。這意味著研究人員可以通過比較miRNA的檢測結果,觀察到細胞的功能和狀態如何演化。為了驗證這個概念,研究人員在小鼠胚胎幹細胞分化成運動神經元的過程中,應用了他們開發的細胞內活檢技術。

Penetration of cell membrane by nanoneedles
此掃描電子顯微鏡圖像顯示金剛石納米針刺穿了細胞膜。(圖片來源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971)

 

「從實驗結果中,我們可以知道有多少百分比的幹細胞已分化成運動神經元或者其他細胞類型,還可以知道不同細胞群體之間的演化關係。這些分析是目前其他檢測方法所無法做到的。」史博士解釋道。

Cell heterogeneity revealed by inCell-biopsy
inCell-Biopsy檢測揭示了小鼠胚胎幹細胞異質性的動態演變。miRNA檢測結果顯示,幹細胞在分化的第7天(圖a)形成了四個群組(意味著這些幹細胞已轉化為四種類型的細胞),然後在第14天形成五個群組(圖b)。(圖片來源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971)
 

 

成為治療策略質量控制的潛在平台

史博士認為細胞內活檢技術能提供機會,令研究人員可以定量檢測同一批細胞內miRNA表達於時序上的動態變化,以揭示混合細胞群中細胞異質性的演變。技術可以應用作一個快速又方便的評估平臺,對涉及運用人類細胞的新興治療策略,如幹細胞療法或CAR T-細胞療法(透過基因技術令病人自身免疫細胞能辨認並殺死癌細胞),進行質量控制,從而令治療更加安全有效。

此外,miRNA檢測近來在醫療保健市場中被應用於早期癌症篩查。研究團隊相信,他們開發的新技術易於轉移,並且與現有醫療保健用途相容,能夠顯著地使相關檢測更快、更簡單。團隊已經著手於一項結腸癌篩查研究,以測試該技術。

史博士補充說:「我們的技術不單能用於幹細胞,亦可用於血液細胞、癌細胞或T-細胞等細胞,檢測的對象亦不限於miRNA,還可以應用於不同種類的RNA,甚至適用於COVID-19病毒的檢測。」

論文的所有作者均來自香港城大。史博士、生物醫學系的王鑫博士黃林峰博士、以及張文軍教授都是論文的共同通訊作者。論文的共同第一作者包括來自生物醫學工程學系的王子迅博士和來自生物醫學系的齊林,以及香港城大畢業生、現為深圳先進技術研究院副研究員的楊揚博士

這項研究獲得國家自然科學基金委員會、深圳市科技創新委員會、香港研究資助局、和香港食物及衞生局轄下醫療衞生研究基金的資助進行。

DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971

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