快速检测小分子核糖核酸(microRNAs)的细胞内活检技术

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小分子核糖核酸(下简称miRNA)近年在关于癌症或其他人类疾病的研究中越来越受关注,其表达的变化与异常的细胞功能有着密切的关系。香港城市大学(香港城大)一支研究团队最近开发了一种运用金刚石*纳米针的新型细胞内活检技术,能够对miRNA进行快速和灵敏度高的高通量检测。该技术只需要约10分钟,就可以从活细胞中分离出目标miRNA,操作简单兼可应用于其他方面,包括用在COVID-19等病毒的核酸检测,以及早期癌症筛查。

*金刚石是打磨成钻石之前的原石,有天然金刚石和人造金刚石两种;人造金刚石通常作工业或其他科技应用。

有关研究由香港城大生物医学工程学系副教授史鹏博士领导。研究结果刚在科学期刊《科学进展》(Science Advances)上发表,题为〈High-throughput intracellular biopsy of microRNAs for dissecting the temporal dynamics of cellular heterogeneity〉。

近乎单细胞的miRNA分析


miRNA是短链非编码RNA的片段,负责基因表达的转录后调控,精密地调控细胞分化、增殖和存活等不同的生物过程。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是目前最普遍的miRNA分析方法,但是成本高且过程复杂,牵涉从细胞裂解物中分离、纯化和扩增RNA等过程,因此处理费时费力。此外,单细胞个体之间存在一定的差异,但传统的PCR方法只能对数以万计细胞的miRNA平均水平进行测量。而区别细胞个体的差异对于识别和检测稀有细胞,例如癌症干细胞(引致癌症复发和转移的主要因素之一),尤其重要。

针对这些不足之处,香港城大研究团队成功开发了一种命名为 「inCell-Biopsy」的高通量细胞内活检技术,作为miRNA检测的替代方法。该技术无需进行分离、纯化和扩增RNA的过程,实验操作大为简化。因此,所需的处理时间从数小时大幅缩减至只需要约10分钟。

该技术以团队早前开发的「分子垂钓」(“molecular fishing”)系统为基础,将金刚石纳米针用作「鱼竿」,并加上会与RNA结合的蛋白质P19,用作「鱼钩」。 P19可以与所有长度为19至24个核苷酸的双链RNA结合。操作的时候「鱼竿」会刺穿细胞膜,然后直接拉出由「鱼钩」捕获(即与P19结合了)的多个目标miRNA,而被刺穿的细胞仍然存活。随后研究人员会分析数以万计的金刚石纳米针上的「渔获」,从而对数千被同时活检的细胞实现近乎是单细胞的miRNA分析。

inCell-Biopsy技术以金刚石纳米针为「鱼竿」,并加上会与RNA结合的蛋白质P19为「鱼钩」。 纳米针会刺穿细胞膜,然后直接拉出由「鱼钩」捕获的多个目标miRNA,而被刺穿的细胞仍然存活。(视频来源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971)

史博士解释说:「目前每次纳米针的穿刺我们可以同时检测9个目标miRNA,这个数量可以通过改良以进一步提高。而且,每一片包含金刚石纳米针的生物芯片都可以清洗,并重复使用至少50次以上。」金刚石纳米针由材料科学讲座教授张文军教授研制,并已由香港城大取得专利。

Fishing miRNAs from individual living cells
图解细胞内miRNA活检技术。金刚石纳米针被用作「鱼竿」,而会与RNA结合的蛋白质P19则被用作「鱼钩」,由活细胞中拉出多个目标miRNA。(图片来源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971)

 

捕捉同一细胞群在不同时间miRNA表达的变化

有别于以PCR为基础的检测方法需要裂解细胞样本(即细胞已经死亡)来获取RNA,采用团队开发的细胞内活检技术,细胞被纳米针刺穿后仍然健康。因此,研究人员可以多次分析同一细胞群,以监测与细胞功能相关的miRNA变化。这意味着研究人员可以通过比较miRNA的检测结果,观察到细胞的功能和状态如何演化。为了验证这个概念,研究人员在小鼠胚胎干细胞分化成运动神经元的过程中,应用了他们开发的细胞内活检技术。

Penetration of cell membrane by nanoneedles
此扫描电子显微镜图像显示金刚石纳米针刺穿了细胞膜。(图片来源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971)

 

「从实验结果中,我们可以知道有多少百分比的干细胞已分化成运动神经元或者其他细胞类型,还可以知道不同细胞群体之间的演化关系。这些分析是目前其他检测方法所无法做到的。」史博士解释道。

Cell heterogeneity revealed by inCell-biopsy
inCell-Biopsy检测揭示了小鼠胚胎干细胞异质性的动态演变。miRNA检测结果显示,干细胞在分化的第7天(图a)形成了四个群组(意味着这些干细胞已转化为四种类型的细胞),然后在第14天形成五个群组(图b)。(图片来源:DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971)

 

成为治疗策略质量控制的潜在平台

史博士认为细胞内活检技术能提供机会,令研究人员可以定量检测同一批细胞内miRNA表达于时序上的动态变化,以揭示混合细胞群中细胞异质性的演变。技术可以应用作一个快速又方便的评估平台,对涉及运用人类细胞的新兴治疗策略,如干细胞疗法或CAR T-细胞疗法(透过基因技术令病人自身免疫细胞能辨认并杀死癌细胞),进行质量控制,从而令治疗更加安全有效。

此外,miRNA检测近来在医疗保健市场中被应用于早期癌症筛查。研究团队相信,他们开发的新技术易于转移,并且与现有医疗保健用途兼容,能够显著地使相关检测更快、更简单。团队已经着手于一项结肠癌筛查研究,以测试该技术。

史博士补充说:「我们的技术不单能用于干细胞,亦可用于血液细胞、癌细胞或T-细胞等细胞,检测的对象亦不限于miRNA,还可以应用于不同种类的RNA,甚至适用于COVID-19病毒的检测。」

论文的所有作者均来自香港城大。史博士、生物医学系的王鑫博士黄林峰博士、以及张文军教授都是论文的共同通讯作者。论文的共同第一作者包括来自生物医学工程学系的王子迅博士和来自生物医学系的齐林,以及香港城大毕业生、现为深圳先进技术研究院副研究员的杨扬博士

这项研究获得国家自然科学基金委员会、深圳市科技创新委员会、香港研究资助局、和香港食物及卫生局辖下医疗卫生研究基金的资助进行。

DOI number: 10.1126/sciadv.aba4971
 

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